應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑼貙?基因測序或成下一風(fēng)口

近期，一場由全球主要基因編輯工作者發(fā)起人類基因編輯國際峰會在華盛頓舉行，探討了與基因編輯技術(shù)有關(guān)的各項熱門議題。峰會聲明并未嚴(yán)厲禁止對于早期人類胚胎或生殖細(xì)胞的基因編輯行為，研究人員仍可進行基礎(chǔ)的研究。這意味著目前的重點仍將是基因編輯技術(shù)本身發(fā)展和潛在應(yīng)用。

基因編輯 為重癥患者打開希望之門

當(dāng)一顆受精卵開始分裂發(fā)育，細(xì)胞中DNA攜帶的遺傳因子決定了胚胎將具有親代的各種特征。如果親代攜帶某些嚴(yán)重疾病的遺傳基因的話，那么子代不幸的命運或許在未出生前已經(jīng)注定。除卻遺傳因素，DNA無數(shù)次復(fù)制過程中出現(xiàn)意外(基因突變)，也將令生命個體備受掙扎。目前的醫(yī)學(xué)水平，卻對上述的困境無能為力。而在可期的將來，一切將有所改變。

12月初，由美國國家科學(xué)院、美國國家醫(yī)學(xué)院、中國科學(xué)院和英國皇家學(xué)會共同舉辦人類基因編輯國際峰會上透露，通過基因編輯技術(shù)有望治療B型血友病。

資料顯示，B型血友病是由指示肝臟產(chǎn)生凝血因子IX的基因發(fā)生突變引起的，是一種遺傳性疾病。患者會因凝血功能紊亂而自發(fā)性內(nèi)出血，并可能因難以止血而面臨生命危險。患者往往如玻璃人般整日過著膽戰(zhàn)心驚的生活。

此次在峰會上透露的臨床試驗消息顯示，美國科學(xué)家使用ZFN(鋅指核酸酶)基因編輯工具，在基因組中插入一種正確版本的突變基因，并遞送到了缺乏因子IX基因的小鼠和靈長類動物的肝臟中。科學(xué)家們宣布實驗動物的凝血功能恢復(fù)了正常。很快將在成人血友病B患者身上開展試驗。未來還將把這項技術(shù)轉(zhuǎn)移到兒科領(lǐng)域。

就在一個月前，英國方面才剛宣布通過基因編輯技術(shù)治好了一名1歲大的白血病患兒。該名患兒被確診患有急性淋巴細(xì)胞白血病，常規(guī)的化療以及骨髓移植治療方式對其已無法奏效。在其父母的支持下，醫(yī)院采用德國生物技術(shù)公司Cellectis開創(chuàng)的細(xì)胞方法治療這名患兒。科學(xué)家們利用了名為TALENs(類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶)的基因編輯工具對來自美國的捐贈者的血液進行了3次編輯。關(guān)閉了兩個基因，并添加了抗白血病基因，最終將1ml含有5000個編輯過的細(xì)胞注入患兒體內(nèi)，令患兒身體恢復(fù)并能夠接受骨髓移植術(shù)。術(shù)后患兒接受檢查發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞已經(jīng)完全消除。這項大膽的試驗此前僅在小白鼠身上試驗過。

多倫多病童醫(yī)院的研究人員則宣布利用另一種基因編輯工具，令杜氏肌營養(yǎng)不良患者的細(xì)胞中恢復(fù)了蛋白功能。

由此可見，基因編輯技術(shù)給重癥患者帶來了重生的希望。利用基因編輯技術(shù)矯正致病突變，治療人類疾病有著廣闊的前景。

化繁為簡 CRISPR-Cas9開創(chuàng)新紀(jì)元

事實上，刪除、加入或改變一個基因組中的DNA，科學(xué)家們在很多年前就能做到，但可能需要一年或更長的時間來進行復(fù)雜的基因組修飾，而使用的動物幾乎只有小白鼠。近年來陸陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一系列基于核酸酶的可編程基因組編輯技術(shù)，令研究人員能在任何物種中實現(xiàn)精確的基因修飾，并有著核苷酸水平的精確度。

ZEN和TALENs工具便屬于其中的兩種，本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA的靶向識別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變，為人工核酸酶技術(shù)。ZFN 的基因打靶效率能夠達(dá)30%左右，但ZFN的脫靶切割會導(dǎo)致細(xì)胞毒性，令其在基因治療領(lǐng)域具有局限性。TALENs工具在某種程度上完成了ZFN的大部分工作，但構(gòu)建更簡單，效果也更好。在商用領(lǐng)域，TALENs的試劑盒售價也更為便宜。

到了2012年，新一代基因編輯工具CRISPR-Cas9閃亮登場，它的本質(zhì)功能和ZFN 、TALENs相同。不同的是，CRISPR-Cas9是一個天然存在的原核生物 RNA干擾系統(tǒng)。CRISPR-Cas9 其實是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA.

早在1987年，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌的基因末端有一段間隔重復(fù)的DNA序列。2007年左右，通過對不同細(xì)菌的研究，CRISPR作用機理才逐步清晰。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成三類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。

2012年8月，美國加州伯克利分校Jennifer Doudna和馬克普朗克感染生物研究所Emmanuelle Charpentier在《science》上發(fā)表論文介紹如何使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)工作，并通過更換向?qū)NA序列來實現(xiàn)基因編輯。這種技術(shù)被業(yè)內(nèi)形象地比喻為剪刀分子技術(shù)，意味著用分子剪刀剪除幾段基因組，然后再進行回填和修補，就掌握了技術(shù)的精髓。對于稍微通曉生物醫(yī)學(xué)知識的研究人員而言，只要訂購一段向?qū)NA，利用通用的實驗室材料，就能快速建立需要的模型。成本僅為ZFN的幾十分之一。

此后3年，利用CRISPR-Cas9工具在不同領(lǐng)域應(yīng)用研究論文迅速增加，據(jù)統(tǒng)計達(dá)到650篇之多，由此也可以看出CRISPR-Cas9的易懂易操作性。

安全性不斷增強 倫理問題存爭議

雖然CRISPR-Cas9被業(yè)界熱捧，甚至成為諾貝爾化學(xué)獎的有力競爭者，需要注意的是任何一項全新的科學(xué)技術(shù)都要經(jīng)歷安全性的論證。CRISPR-Cas9之母Jennifer Doudna在2014年參加了一場學(xué)術(shù)會議得知，一位使用CRISPR-Cas9工具的科研者很容易地構(gòu)建出了人肺癌小鼠動物模型。這反而令她擔(dān)憂，如果出現(xiàn)一點問題，那患上肺癌的不是小鼠而是人類。

麻省理工學(xué)院的生物工程師Daniel Anderso認(rèn)為CRISPR藥物很快將進入臨床試驗階段。更多科學(xué)家認(rèn)為需要開展更多的工作，保證CRISPR技術(shù)的安全和功效。因為用于基因編輯的酶在非目標(biāo)區(qū)域發(fā)生作用，或加快細(xì)胞增殖，形成腫瘤。

“許多安全問題都與脫靶效應(yīng)相關(guān)。”從事CRISPR工具研究的另一位知名科學(xué)家張鋒指出。近日，他和團隊則在《science》發(fā)表論文稱，麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院、麻省理工學(xué)院麥戈文人腦研究所的研究人員設(shè)計改造了革命性的CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)，從而顯著減少“脫靶”編輯錯誤。具體而言就是化膿性鏈球菌Cas9酶由約1400個氨基酸組成。在他們研究的具體案例中，改變其中三個氨基酸可顯著地將 “脫靶編輯”減少到不可檢測的水平。研究小組將這種新近改造的酶稱為“增強型”化膿性鏈球菌Cas9，該實驗室很快會將這種增強型酶提供給世界各地的研究人員。

除了安全問題，更令人擔(dān)憂的是快速高效的基因編輯帶來的倫理問題。理論上，通過基因編輯人類未來不僅可以治愈包括癌癥、地中海貧血、艾滋病在內(nèi)的絕癥。還可以運用基因編輯來改造自己的基因并遺傳給下一代。有觀點認(rèn)為最終富人和窮人可能變成不同物種，人類社會也將面臨巨大的挑戰(zhàn)。對于生態(tài)環(huán)境而言，人類完全可以通過基因編輯來改變雜草、害蟲的基因，使其基因帶有某種突變，或令種群滅絕。雖然可能會消滅瘧疾等傳染疾病，但會否因此造成其他生態(tài)問題就不得而知了。

在此次人類基因編輯峰會召開前，便已經(jīng)出現(xiàn)了具有爭議的案例。據(jù)《自然》4月的報道，在中山大學(xué)副教授、基因功能研究員黃軍就的帶領(lǐng)下，科研人員利用CRISPR-Cas9技術(shù)，試圖修改人類胚胎中可能導(dǎo)致β型地中海貧血的基因。根據(jù)進一步的消息，科研人員選用的人類胚胎是卵子和雙精子受精所生成，完全不可能發(fā)育為正常嬰兒。盡管如此還是在業(yè)界引起了巨大的風(fēng)波。反對者認(rèn)為這已經(jīng)觸及了倫理底線，應(yīng)該停止類似的研究。但也不乏支持者，有的科學(xué)家認(rèn)為這種情況下受精卵不一定能定義為生殖細(xì)胞。另有科學(xué)家認(rèn)為僅僅作為研究，利用CRISPR-Cas9技術(shù)編輯人類胚胎和生殖細(xì)胞是可行的。更開放的觀點認(rèn)為，可以對胚胎進行基因編輯，從而使具有基因疾病的嬰兒出生后有更好的生活質(zhì)量。

人類基因編輯峰會發(fā)表的一份聲明，對于研究所涉及的倫理底線也亮明了態(tài)度。這份聲明稱，強化基因編輯技術(shù)的基礎(chǔ)和臨床前期研究“顯然是必要的”，應(yīng)在適當(dāng)?shù)姆珊偷赖卤O(jiān)管監(jiān)督下繼續(xù)開展。但如果在研究中對早期人類胚胎或生殖細(xì)胞進行了基因編輯，那么被修改的細(xì)胞不得用于懷孕目的。對于不會遺傳給后代的體細(xì)胞研究，大多數(shù)科學(xué)家顯然持支持態(tài)度。對于在生殖細(xì)胞能否使用基因編輯技術(shù)，部分科學(xué)家認(rèn)為也不需要永遠(yuǎn)摒棄這一想法。

盡管面臨倫理天花板的爭議，但學(xué)界普遍認(rèn)為基因編輯技術(shù)未來在醫(yī)療健康、生物育種方面仍大有可為。